微生物檢驗的基本操作技術匯總！

無菌操作基礎知識

一、無菌操作技術

1、定義　

是指在執(zhí)行實驗過程中，防止一切微生物侵入機體和保持無菌物品及無菌區(qū)域不被污染的操作技術和管理方法；

無菌操作技術是微生物實驗的基本技術，是保證微生物實驗和順利完成的重要環(huán)節(jié)。

2、內容

無菌操作技術主要包括兩方面：

1）創(chuàng)造無菌的培養(yǎng)環(huán)境。包括密閉的培養(yǎng)容器、培養(yǎng)容器的滅菌、培養(yǎng)基的滅菌等；

2）在操作和培養(yǎng)過程中防止一切其它微生物的侵入的措施。包括紫外線殺菌、甲醛熏蒸、凈臺的消毒與檢測、操作工具、器皿滅菌、操作方法等。

3、無菌操作原則

1）在執(zhí)行無菌操作時，必須明確物品的無菌區(qū)和非無菌區(qū)，接種時必須穿工作服、戴工作帽，應在進無菌室前用肥皂洗手，然后用75%酒精棉球將手擦干凈；

2）在操作前20～30分鐘要先啟動凈臺和紫外燈，進行接種所用的吸管、平皿及培養(yǎng)基等必須經(jīng)消毒滅菌，打開包裝未使用完的器皿，不能放置后再使用，金屬用具應高壓滅菌或用95%酒精點燃燒灼3次后使用。嚴禁用手直接拿無菌物品，如瓶塞等，而必須用消毒的鉗、鑷子等；

3）從包裝中取出吸管時，吸管尖部不能觸及外露部位，使用吸管接種于試管或平皿時，吸管尖不能觸及試管或平皿邊；

4）接種樣品、轉種細菌必須在酒精燈前操作，接種細菌或樣品時，吸管從包裝中取出后及打開試管塞都要通過火焰消毒；

5）接種環(huán)或接種針在接種細菌前應經(jīng)火焰燒灼全部金屬絲，必須時還要燒到環(huán)和針與桿的連接處；

6）吸管吸取菌液或樣品時，應用相應的橡皮頭吸取，不得直接用口吸。傾倒平板應在凈臺內操作，并且在開啟和加蓋瓶塞時需反復用酒精燈燒。

二、無菌操作的環(huán)境要求

1、無菌室

（1）無菌室的結構：更衣間、緩沖間、操作間；

（2）無菌室的消毒和防污染

?每日（使用前）紫外線照射（0.5~1小時）；

?每月用新潔爾滅擦拭地面和墻壁一次的方式進行消毒；

?每季度用甲醛、乳酸、過氧乙酸熏蒸（2小時），特殊情況下可增加熏蒸頻次。

（3）無菌室使用要求

①無菌室內應保持清潔，工作后用2%-3%煤酚皂溶液消毒，拭擦工作臺面，不得存放與實驗無關的物品；

②無菌室使用前后應將門關緊，打開紫外線，如采用室內懸吊紫外燈消毒時，需30W紫外燈，距離在1.0m處，照射時間不少于30min，使用紫外燈，應注意不得直接在紫外線下操作，以免引起損傷，燈管每隔兩周需用酒精棉球輕輕拭擦，除去上面灰塵和油垢，以減少紫外線穿透的影響；

③處理和接種食品標本時，進入無菌室操作，不得隨意出入，如需要傳遞物品，可通過小窗傳遞。在無菌室內如需要安裝空調時，則應有過濾裝置。

2、凈工作臺

凈臺的使用與保養(yǎng)：

（1）風速穩(wěn)定，且符合要求；

（2）使用前開啟紫外燈照射30分鐘以上；

（3）讓凈臺預工作10－15分鐘；

（4）使用完畢后，用70%酒精將臺面和臺內四周擦拭干凈。

3、無菌器材

（1）滅菌器材：玻璃器皿、培養(yǎng)基、無菌衣等；

（2）消毒器材：無菌室內的凳子、試管架、天平、工作臺、手等。

（3）無菌間一般只允許放置無菌操作臺、轉椅等物品；無菌操作臺上一般只允許擺放以下物品： 酒精燈、打火機、接種針、消毒棉球、洗耳球、鑷子、油性筆、滅菌平皿、試管架、滅菌吸管、電子天平、250ml滅菌三角瓶、培養(yǎng)基、均質器等。

三、無菌操作的基本技術

1、無菌接種操作

培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，用經(jīng)過滅菌的工具（如接種針和吸管等）在無菌條件下接種含菌材料（如樣品、菌苔或菌懸液等）于培養(yǎng)基上，這個過程叫做無菌接種操作。

在實驗室檢驗中的各種接種必須是無菌操作。

2、微生物檢驗過程中的無菌操作要求

（1）在操作中不應有大幅度或快速的動作；

（2）使用玻璃器皿應輕取輕放；

（3）在正火焰上方操作；

（4）接種用具在使用前、后都必須灼燒滅菌；

（5）在接種培養(yǎng)物時，協(xié)作應輕、準；

（6）不能用嘴直接吸吹吸管；

（7）帶有菌液的吸管、玻片等器材應及時置于盛有5%來蘇爾溶液的消毒桶內消毒。

3、無菌操作技術詳細圖解

（1）取菌技巧

（2）接種技巧

（3）錯誤示范

微生物的接種、分離純化和培養(yǎng)技術

一、接種

1、接種定義

接種：將微生物接到適于它生長繁殖的人工培養(yǎng)基上或活的生物體內的過程叫做接種。

2、接種工具

在實驗室中，用得zui多的接種工具是接種環(huán)、接種針。有時滴管、吸管也可作為接種工具進行液體接種。在固體培養(yǎng)基表面要將菌液均勻涂布時，需要用到涂布棒。

1．接種針 2.接種環(huán) 3.接種鉤 4.5.玻璃涂棒 6.接種圈 7.接種鋤 8.小解剖刀

3、微生物檢驗常見接種方法

（1）劃線接種法

平板劃線分離法--分區(qū)劃線分離法

①用接種環(huán)先將培養(yǎng)物涂布于平板1區(qū)并作數(shù)次劃線，再在2、3̷̷區(qū)依次劃線；

②每劃完一個區(qū)域，轉動培養(yǎng)皿約70度角，并將接種環(huán)滅菌一次，待冷后再劃下一區(qū)域；

③每一區(qū)域的劃線均接觸上一區(qū)域的接種線1～2次，使接種量逐漸減少，以獲得單個菌落；

④其他操作與上述曲線劃線分離法相同。

（2）斜面接種法

主要用于經(jīng)劃線分離培養(yǎng)所獲得的單個菌落的移種，以及觀察細菌的某些培養(yǎng)特征。

以菌種移種為例，其接種方法是：

①取一菌種管和培養(yǎng)基管，置左手食指、中指、無名指間，拇指壓住兩管底部上側面，使菌種管位于外側，培養(yǎng)基管位于內側；

②右手拇指和食指分別旋松兩管棉塞。火焰滅菌接種環(huán)；

③以右手小指與手掌，小指與無名指分別夾取棉塞（先外管后內管），將兩管口迅速通過火焰1~2次；

④將已滅菌的接種環(huán)伸入菌種管中，從斜面上取菌少許，迅速伸入待接種的培養(yǎng)基管中，在斜面底部向上劃一條直線，然后從底部起向上作曲折連續(xù)劃線，直至斜面上方頂端；

⑤取出接種環(huán)，火焰滅菌管口，塞上棉塞（先塞內管）；zui后將接種環(huán)經(jīng)火焰滅菌放好；

⑥做好標識，置35℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18~24小時。斜面培養(yǎng)一般形成均勻一致的菌苔。一般可觀察表面、透明度、色澤等特征。

（3）涂布接種法

涂布法接種是一種常用的接種方法，不僅可以用于計算活菌數(shù)，還可以利用其在平板表面生長形成菌苔的特點用于檢測化學因素對微生物的抑殺效應。

原理：將一定濃度，一定量的待分離菌液移到已凝固的培養(yǎng)基平板上，再用涂布棒快速地將其均勻涂布，使長出單菌落而達到分離的目的。

（4）液體接種法（肉湯接種）

①如斜面接種法持好菌種管及培養(yǎng)基管；

②滅菌接種環(huán)，從菌種管取菌，伸入培養(yǎng)基管中，在接近液面的管壁上方輕輕研磨，并沾取少許培養(yǎng)基液體調和，使細菌混合于培養(yǎng)基的液體中。液體培養(yǎng)基一般以18~24小時培養(yǎng)后觀察生長特征。

肉湯培養(yǎng)可觀察如下幾項：

a.發(fā)育程度：有無生長、微弱、中等、旺盛；

b.混濁度：有無及程度（混、中等、微混、透明）、均勻混濁、有顆粒、絮狀生長；

c.沉淀：有無及量多少、性狀（粉狀、顆粒狀、絮狀、沾性）；

d.表面：有無生長、性狀（膜狀、環(huán)狀）、菌膜厚薄及表面特征（光滑、顆粒、皺狀）；

e.其他：有無特殊氣味，色素。如果是糖發(fā)酵培養(yǎng)基則主要觀察是否產酸和有無氣體。

（5）穿刺接種法（半固體接種）

多用于保存菌種、觀察動力及厭氧培養(yǎng)等也可以用于觀察細菌的某些生化反應。

①如斜面接種法持好菌種管及培養(yǎng)基管；

②以滅菌接種針從菌種管取菌，垂直刺入培養(yǎng)基的中心（半固體或一般瓊脂高層）直達近管底部（但不能刺到管底），接種針應沿原路退出；

③經(jīng)培養(yǎng)后半固體培養(yǎng)基可觀察到：沿穿刺線生長，線外的培養(yǎng)基清亮表示細菌無動力；穿刺線模糊不清，或沿穿刺線向外擴散生長，或整個培養(yǎng)基混濁表示細菌有動力。

二、分離純化

1、幾個定義

混和培養(yǎng)物：含有一種以上的微生物培養(yǎng)物稱為混和培養(yǎng)物（Mixed culture）；

純培養(yǎng)：如果在一個菌落中所有細胞均來自于一個親代細胞，那么這個菌落稱為純培養(yǎng)（Pure culture）；

分離純化：在進行菌種鑒定時，所用的微生物一般均要求為純的培養(yǎng)物，得到純培養(yǎng)的過程稱為分離純化。包括傾注平板法、涂布平板法、平板劃線法等等。

2、傾注平板法（倒平板）

將無菌培養(yǎng)皿放入生物安全柜或凈化臺中，然后分別倒入15ml已融化并且冷卻至45℃左右的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，加蓋后輕輕搖動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布，待凝固之后，把這平板倒置在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。單一細胞經(jīng)過多次增殖后形成一個菌落，取單個菌落制成懸液，重復上述步驟數(shù)次，便可得到純培養(yǎng)物。整個操作過程應嚴格按照無菌操作。

三、微生物的培養(yǎng)方法

微生物的生長，除了受本身的遺傳特性決定外，還受到許多外界因素的影響，如營養(yǎng)物濃度、溫度、水分、氧氣、pＨ等。微生物的種類不同，培養(yǎng)的方式和條件也不盡相同。通常分為：

1、一般培養(yǎng)法（需氧培養(yǎng)）    

培養(yǎng)溫度：25~37℃ 。

2、厭氧培養(yǎng)方法

（1）簡易的厭氧培養(yǎng)法：

A、庖肉培養(yǎng)法

B、鐵絲圈厭氧培養(yǎng)法

C、焦性沒食子酸法

（2）厭氧罐法

（3）厭氧手套箱法

厭氧缸法：

厭氧缸是普通的干燥缸，用物理化學的方法使缸內造成厭氧環(huán)境，從而將厭氧菌培養(yǎng)出來。

接種好標本的平板或液體培養(yǎng)基試管，可放入?yún)捬醺變扰囵B(yǎng)。

厭氧罐法：

裝入待培養(yǎng)的對象，然后密閉罐蓋，接著可采用抽真空→灌氮→抽真空→灌氮→抽真空→灌混合氣（N2∶CO2∶H2=80∶10∶10，V/V）。

3、二氧化碳培養(yǎng)法

（1）燭缸法

（2）二氧化碳置換法

（3）化學法

每一升用重碳酸鈉0.4克與濃鹽酸0.35亳升加入。

（4）二氧化碳培養(yǎng)箱法

四、微生物常規(guī)鑒定技術

1、形態(tài)結構和培養(yǎng)特性觀察

（1）在固體培養(yǎng)基上，觀察：

菌落大小、形態(tài)、顏色（色素是水溶性還是脂溶性）、光澤度、透明度、質地、隆起形狀、邊緣特征及遷移性等；

（2）在液體培養(yǎng)中：

表面生長情況（菌膜、環(huán)）混濁度及沉淀等；

（3）半固體培養(yǎng)基穿刺接種：

觀察運動、擴散情況。

2、染色鏡檢

（1）染色原理

由于微生物細胞含有大量水分，機體是無色透明的，與周圍背景沒有明顯的反差， 必須進行染色，使經(jīng)染色后的菌體與背景形成明顯的色差，從而能更清楚地觀察到其形態(tài)和結構。

微生物中細菌、致病菌是很小的生物體，必須通過染色的方法，在顯微鏡下才能看得清楚，并且還可以通過染色的方法鑒別革蘭氏染色特性，以及是否長有鞭毛、周毛、莢膜和芽孢等。

（2）染色方法

①簡單染色法

簡單染色法又叫作普通染色法，只用一種染料使細菌染上顏色，觀察細菌的形態(tài)。

②復染色法

用兩種或多種染料染細菌，目的是為了鑒別不同性質的細菌，所以又叫鑒別染色法。主要的復染色法有革蘭氏染色法和抗酸性染色法。

（3）革蘭氏染色法

①原理

革蘭氏染色法是細菌學中廣泛使用的一種鑒別染色法。1884年由丹麥醫(yī)師Gram創(chuàng)立。

染色反應呈藍紫色的稱為革蘭氏陽性細菌，用G+表示；

染色反應呈紅色的稱為革蘭氏陰性細菌，用G―表示。

細菌對革蘭氏染色的不同反應，是由于它們細胞壁的成分和結構不同而造成的。

②細菌的革蘭氏染色步驟

涂片→干燥→固定→初染→水洗→媒染→水洗→脫色→水洗→復染→水洗→干燥→觀察

A）取培養(yǎng)物分別做涂片、干燥、固定，方法均與簡單染色的相同；

B）用草酸銨結晶紫染色1min后水洗；

C）加碘液媒染1min后水洗；

D）斜置載玻片，滴加95％乙醇脫色，至流出的乙醇不現(xiàn)紫色為止，大約需時20～30s，隨即水洗；

E）用蕃紅染液復染30s，水洗；

F）用吸水紙吸掉水滴，待標本片干后置顯微鏡下，用低倍鏡觀察，發(fā)現(xiàn)目的物后用油鏡觀察，注意細菌細胞的顏色。